El reloj transcriptómico predice cambios vasculares de la retinopatía diabética prodrómica

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12968 (2023) Citar este artículo

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La retinopatía diabética es una complicación común de la diabetes a largo plazo y que podría provocar pérdida de visión. Lamentablemente, la retinopatía diabética temprana sigue siendo poco conocida. No existe una forma eficaz de prevenir o tratar la retinopatía diabética temprana hasta que los pacientes desarrollen etapas posteriores de la retinopatía diabética. La densidad capilar acelular elevada se considera un rasgo cuantitativo confiable presente en el desarrollo temprano de la retinopatía. Por lo tanto, en este estudio, interrogamos los cambios transcriptómicos vasculares completos de la retina a través de un modelo de rata del Nilo para comprender mejor la patogénesis temprana de la retinopatía diabética. Descubrimos la complejidad de las asociaciones entre la densidad capilar acelular y los factores conjuntos de glucosa en sangre, dieta y sexo, que se modeló a través de una red bayesiana. Utilizando regresiones segmentadas, hemos identificado diferentes patrones de expresión genética y términos enriquecidos de ontología genética (GO) asociados con el aumento de la densidad capilar acelular. Desarrollamos un modelo de regresión forestal aleatoria basado en patrones de expresión de 14 genes para predecir la densidad capilar acelular. Dado que la densidad capilar acelular es un rasgo cuantitativo confiable en la retinopatía diabética temprana, nuestro modelo puede usarse como un reloj transcriptómico para medir la gravedad de la progresión de la retinopatía temprana. También identificamos NVP-TAE684, geldanamicina y NVP-AUY922 como los tres principales fármacos potenciales que potencialmente pueden atenuar la RD temprana. Aunque necesitamos más estudios in vivo en el futuro para respaldar nuestros medicamentos reutilizados, hemos proporcionado un enfoque basado en datos para el descubrimiento de fármacos.

La retinopatía diabética es una complicación común de la diabetes a largo plazo que produce daño a los vasos sanguíneos de la retina y puede progresar hacia la pérdida de la visión. En varios países desarrollados, incluido Estados Unidos, la retinopatía diabética es la principal causa de nuevos casos de ceguera entre adultos de 20 a 741 años. Las personas que viven con diabetes, independientemente de los subtipos clínicos, tienen aproximadamente un tercio de posibilidades de desarrollar retinopatía diabética2 , afectando de manera similar tanto a hombres como a mujeres en general3,4.

En las primeras etapas, la retinopatía diabética (RD) no proliferativa se puede detectar mediante pruebas de detección cuando la visión aún no está afectada. Sin embargo, no existe una forma eficaz de ralentizar o detener la progresión de la enfermedad para prevenir la pérdida de visión, donde los pacientes frecuentemente no reciben tratamiento hasta etapas posteriores. Además, la retinopatía diabética no es reversible y seguirá progresando. Con el tiempo, algunos casos evolucionarán hacia una retinopatía diabética proliferativa, en la que se desarrolla fibrosis en la superficie de la retina y nuevos vasos anormales propensos a hemorragias provocan la pérdida de la visión5. Para prevenir la pérdida de visión por retinopatía diabética, debemos comprender la patogénesis temprana de la retinopatía asintomática. Desafortunadamente, estos procesos tempranos siguen siendo poco conocidos, en parte debido a la insuficiencia de material histológico de donantes humanos y a los limitados modelos animales que pueden recapitular la progresión natural de la retinopatía diabética humana6.

La rata del Nilo (Arvicanthis niloticus), originaria del norte de África, es un roedor diurno cuya dieta general consiste en tallos de pasto7. Sin embargo, cuando se alimenta con una comida convencional para roedores en un entorno de laboratorio, la rata del Nilo desarrolla rápidamente diabetes inducida por la dieta en ambos sexos. Para aclarar, la comida convencional para roedores, aunque destinada a mantener sanos a los roedores comunes de laboratorio, es hipercalórica, en relación con la dieta nativa, para las especies de ratas del Nilo y de ahí en adelante se describirá como una dieta alta en calorías. Para prevenir la diabetes inducida por la dieta en un entorno de laboratorio, se puede alimentar a la rata del Nilo con una dieta rica en fibra8. Por lo tanto, la diabetes inducida por la dieta en la rata del Nilo parece seguir la progresión natural de la diabetes tipo 2 en los humanos. Nuestro estudio anterior demostró que las ratas diabéticas del Nilo podrían desarrollar retinopatía con lesiones retinianas avanzadas similares a las características clínicas relacionadas con la pérdida de visión en humanos, como edema macular, falta de perfusión capilar y retinopatía diabética proliferativa9. Específicamente, las lesiones de las ratas del Nilo incluyeron fuga de retina, engrosamiento de la retina, falta de perfusión capilar, anomalías microvasculares intrarretinianas y aparente retinopatía diabética proliferativa, según la neovascularización observada más allá de la superficie de la retina9. Por lo general, otros modelos de roedores con retinopatía diabética inducida por la dieta no exhiben el daño microvascular exacto que se observa en los humanos y, a menudo, carecen de neovascularización proliferativa. Sin embargo, se observó neovascularización en ratas del Nilo relativamente mayores y la edad podría desempeñar un papel en la neovascularización. En ese estudio, también demostramos que la densidad capilar acelular elevada es un rasgo cuantitativo confiable presente en el desarrollo inicial de la retinopatía, que precede a una disfunción vascular adicional en los pericitos y las células endoteliales. El uso de la densidad capilar acelular de la retina como uno de los primeros marcadores de retinopatía es consistente tanto en ratas del Nilo9 como en humanos10. Por lo tanto, razonamos que el cambio en la vasculatura retiniana es un factor causal importante en el inicio e impulso de la patogénesis de la retinopatía diabética. Dado que la densidad de los capilares acelulares de la retina es uno de los cambios detectables iniciales relevantes para la disfunción vascular de la retina, podríamos utilizar la densidad de los capilares acelulares para marcar la progresión temprana de la enfermedad en la retinopatía diabética.

En este estudio, buscamos firmas genéticas que correspondan a la progresión del aumento de la densidad capilar acelular en la red vascular de toda la retina. Realizamos RNA-Seq en tejido vascular retiniano recién aislado de 28 ratas del Nilo machos y hembras con una dieta alta en calorías o alta en fibra. Sabíamos por nuestro estudio anterior que la densidad capilar acelular es un fenotipo bilateral en el que los ojos izquierdo y derecho están altamente correlacionados en ratas del Nilo individuales9. Aprovechando la naturaleza bilateral de este fenotipo, podríamos usar un ojo para determinar la densidad capilar acelular que requería tejido fijo y el ojo contralateral para recolectar tejido fresco para la secuenciación de ARN. Identificamos firmas genéticas asociadas con el aumento de la densidad capilar acelular, un marcador cuantitativo de retinopatía temprana. Utilizando un modelo de aprendizaje automático de bosque aleatorio, identificamos una combinación de catorce genes que pueden predecir cuantitativamente la densidad capilar acelular y que puede servir como un reloj transcriptómico vascular específico que denota la progresión de la retinopatía.

Aprovechando una base de datos de firmas de expresión genética perturbada de compuestos químicos/fármacos a gran escala (LINCS L1000), identificamos NVP-TAE684, geldanamicina y NVP-AUY922 como los tres principales fármacos potenciales que pueden revertir las firmas genéticas correlacionadas con la densidad capilar acelular, proporcionando así candidatos a fármacos putativos para abordar las primeras etapas de la retinopatía. Curiosamente, tanto geldanamicina como NVP-AUY922 son inhibidores de Hsp9011,12. Los estudios han demostrado que los inhibidores de Hsp90 pueden prevenir la degeneración de la retina en modelos de retinitis pigmentosa y degeneración macular relacionada con la edad13. Aunque nuestros fármacos candidatos reutilizados requieren una mayor validación in vivo, hemos proporcionado un enfoque novedoso basado en datos para priorizar compuestos que potencialmente pueden bloquear la progresión de la retinopatía antes de la discapacidad visual permanente. Nuestro estudio también revela la transcriptómica vascular retiniana asociada con la patogénesis temprana de la retinopatía.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California en Santa Bárbara y se realizaron de acuerdo con la Guía de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio; protocolo de estudio 893. Las ratas del Nilo fundadoras de UCSB se derivaron de la colonia del Laboratorio KC Hayes de la Universidad Brandeis. Las ratas del Nilo en UCSB se alojan en una habitación con ciclo de luz de 12 h (de 10 a. m. a 10 p. m.) a 21–26 °C en una instalación convencional con jaulas ventiladas individualmente y se les proporciona Sanichips esterilizado en autoclave como material de cama, con enriquecimiento adicional de la jaula, que incluye bloques de madera y huesos de plástico. No se administró insulina a las ratas diabéticas. Para evitar efectos adversos graves de la diabetes, sacrificamos a todos los animales con una pérdida de peso superior al 5 % o una caída importante de más de 100 mg/dL en RBG. Para identificar a estos animales, realizamos un control semanal del peso y RBG de todas las ratas del Nilo después de que alcanzaron RBG ≥ 500 mg/dL.

Las ratas del Nilo se alimentan con una dieta rica en fibra (Lab Diet 5L3M; Newco Speciality, Rancho Cucamonga, CA, EE. UU.) o con una dieta alta en calorías (Formulab Diet 5008; Newco Speciality, Rancho Cucamonga, CA, EE. UU.)14. El porcentaje de fibra cruda es del 23% para la dieta rica en fibra y sólo del 4% para la dieta alta en calorías. La proporción del porcentaje de calorías aportadas por los carbohidratos, las grasas y las proteínas fue de 67:10:23 para la dieta rica en fibra y de 56:17:27 para la dieta alta en calorías. Los niveles aleatorios de glucosa en sangre (RBG) se miden utilizando un glucómetro (Contour) cada cuatro semanas (entre las 2 y las 5 p.m.) a partir de la edad del destete (4 semanas de edad) con sangre de un pinchazo en la cola. En este estudio participaron un total de 32 ratas del Nilo. Cuatro de treinta y dos muestras de ratas del Nilo fallaron en el paso de la biblioteca RNA-seq (vasculatura retiniana completa). Por lo tanto, tenemos 28 ratas del Nilo en total para el análisis de datos de RNA-seq. La información detallada de las ratas del Nilo, como la densidad capilar acelular, el promedio de glucosa en sangre aleatoria, la duración de la diabetes, el sexo, la edad, la dieta y si se incluye en el análisis de datos de RNA-seq, se muestra en la Tabla complementaria 1. Todos los animales son monitoreado para detectar signos de desarrollo de complicaciones diabéticas que se considerarían angustiantes para el animal, que incluyen, entre otros, deshidratación (polidipsia y poliuria severas, una indicación de insuficiencia renal), o debilidad o letargo pronunciado y sostenido, cuando aplicaremos el punto final humano para estos animales angustiados. La eutanasia se lleva a cabo mediante inhalación de dióxido de carbono. Este estudio se informa de acuerdo con las pautas de ARRIVE (https://arriveguidelines.org).

De cada animal, hicimos una digestión con tripsina en una retina y recolectamos la vasculatura retiniana para RNA-Seq de la otra retina. La vasculatura de la retina se aflojó de otras células de la retina mediante lisis osmótica, donde la retina se colocó en agua libre de RNasa durante 1 hora a 4 ° C en un agitador. A continuación, se aspiró agua y el tejido retiniano restante se incubó en una solución de ADNasa al 10% a 37 °C durante 15 minutos. Luego, la retina se transfirió a una placa de Petri con agua libre de RNasa. Trabajando bajo un microscopio de disección, utilizamos una pipeta P200 para rociar agua sobre la retina hasta que se desprendió la membrana limitante interna y las células neuronales se eliminaron de la vasculatura retiniana. Finalmente, la vasculatura retiniana resultante se conserva en ARN más tarde durante la noche a 4 °C y se almacena a -80 °C. Para la digestión con tripsina, utilizamos nuestro método publicado anteriormente9.

Los ARN totales de 32 muestras vasculares de ratas del Nilo se aislaron usando trizol (ThermoFisher #15596018) y separaciones de fases con cloroformo seguido del mini protocolo RNeasy (Qiagen #74106) con digestión con ADNasa en columna opcional (Qiagen #79254). Se utilizaron cien nanogramos de ARN total para preparar bibliotecas de secuenciación utilizando el protocolo LM-Seq (Secuenciación mediada por ligadura)15. Los ARN se seleccionaron utilizando el kit de aislamiento NEB Next Poly A + (NEB n.º E7490S/L). Las fracciones Poli A+ se eluyeron, se cebaron y se fragmentaron durante 7 min a 85 °C. La primera síntesis de ADNc se realizó utilizando la transcriptasa inversa SmartScribe (Takara Bio USA #639538) y se eliminó el ARN. Los fragmentos de ADNc se purificaron con perlas AMpure XP (Beckman Coulter #A63881). Se ligó el adaptador 5' y se realizaron 18 ciclos de amplificación. Estas bibliotecas de ADNc indexadas finales se cuantificaron, normalizaron, multiplexaron y ejecutaron como lecturas de un solo extremo en el secuenciador HiSeq 3000. Cuatro de treinta y dos muestras de RNA-seq de ratas del Nilo fallaron durante el paso de preparación de la biblioteca y, por lo tanto, se excluyeron del análisis de datos de RNA-seq. Por lo tanto, hay 28 muestras de secuencias de ARN de ratas del Nilo en el análisis de datos posterior.

Utilizamos nuestra herramienta CRSP desarrollada en laboratorio16 para estimar los valores de expresión genética de los tejidos vasculares de la retina de la rata del Nilo. Específicamente, las lecturas de RNA-seq de la vasculatura retiniana se asignaron a los contigs transcriptómicos de ratas del Nilo preconstruidos en nuestro laboratorio, ensamblados mediante la herramienta Trinity17 basada en una secuenciación ultra profunda (2,3 mil millones × 2 lecturas de extremos emparejados) de 22 órganos principales de ratas del Nilo agrupados16. . Los cóntigos transcriptómicos se anotaron en función de proteínas de ratón mediante la herramienta NCBI BLASTX18 con un valor E <10–5. Se realiza una estimación de abundancia a nivel de contig a través de RSEM19. Para cada muestra de RNA-seq vascular de retina de rata de pasto del Nilo, se obtienen recuentos de lecturas mapeadas de RNA-seq a nivel genético sumando los recuentos de los contigs que están mapeados en proteínas con el mismo símbolo genético. Las abundancias relativas, en términos de transcripciones por millón (TPM), de los genes se calcularon normalizando primero el recuento de fragmentos de cada gen mediante la suma de las "longitudes efectivas" (longitud menos la longitud leída) de los contigs asignados a ese gen y luego escalar los valores resultantes de modo que sumen un millón en todos los genes. Los valores de TPM se normalizaron aún más mediante el método de la mediana de la relación mediante el paquete EBSeq20 R.

Se tomaron micrografías para la cuantificación con una cámara digital Canon Rebel XSi (Canon, Tokio, Japón) conectada a un microscopio Olympus CKX41 mediante una montura C de alcance LM. Para los recuentos de capilares acelulares, se tomaron 12 micrografías de 3 áreas seleccionadas al azar en cada uno de los 4 cuadrantes de la retina y se analizaron con un aumento final de ×200. Clasificamos las características capilares anormales en tres grupos: el primer grupo son los capilares acelulares definitivos; el segundo grupo son los procesos pericitos (descritos en nuestro artículo9) y el tercer grupo son las características anormales ambiguas que eran muy cortas o, a veces, parcialmente oscurecidas por otros vasos. El área total utilizada para la cuantificación correspondió a aproximadamente el 8,5% de toda el área de la retina. Los recuentos fueron cuantificados utilizando el software informático de FIJI sin ningún complemento adicional por parte de dos calificadores enmascarados.

Para detectar patrones de expresión génica asociados con los niveles de densidad capilar acelular, realizamos un análisis de regresión segmentada. La regresión segmentada es un método en el que la variable independiente se divide en intervalos y una regresión lineal separada para ajustarse a cada intervalo. Para cada gen, el número de puntos de interrupción se determinó mediante el criterio de información bayesiano (BIC) más bajo21 enumerando todos los K (K <= N) un número posible de puntos de interrupción, donde N era el número de puntos de tiempo. Se encontrará un modelo óptimo para cada gen. Además, definimos la bondad de ajuste del modelo óptimo como el coeficiente de correlación ajustado R2:

donde es la K óptimamente elegida para un gen específico y N es el número de puntos de tiempo. Para estimar aún más la tasa de descubrimiento falso (FDR), permutamos los datos y evaluamos la distribución de fondo de R2. Solo consideramos que los genes con FDR <5% son un buen ajuste. La regresión segmentada fue implementada por el paquete Trendy22 R.

El análisis de enriquecimiento de ontología genética (GO) se realizó utilizando el paquete R (“allez”)23. Los valores de p de enriquecimiento se ajustaron aún más mediante la corrección de prueba múltiple de Benjamini-Hochberg (BH).

Utilizamos el modelo de regresión de bosque aleatorio (RFR) para predecir la densidad capilar acelular de la retina a partir de patrones de expresión genética. RFR es un algoritmo de aprendizaje automático supervisado que utiliza un método de aprendizaje conjunto para la regresión. El método de aprendizaje conjunto es una técnica que combina predicciones de múltiples modelos de aprendizaje automático para realizar una predicción más precisa que un solo modelo. RFR construye una multitud de árboles de decisión en el momento del entrenamiento. Aprovecha dos técnicas de aprendizaje automático: embolsado24 y selección aleatoria de características. En el embolsado, cada árbol se entrena con una muestra de arranque de los datos de entrenamiento y, al agregar los resultados de la predicción, se realizan predicciones a partir de los árboles. RFR selecciona aleatoriamente un subconjunto de características para dividir en cada nodo al hacer crecer un árbol. Para evaluar el rendimiento de predicción del algoritmo de bosque aleatorio, RFR realiza un tipo de validación cruzada en paralelo con el paso de entrenamiento utilizando las llamadas muestras fuera de bolsa (OOB). Específicamente, cada árbol se cultiva utilizando una muestra de arranque particular en el entrenamiento. Dado que el arranque es un muestreo con reemplazo de los datos de entrenamiento, algunas secuencias quedarán "fuera" de la muestra, mientras que otras se repetirán en la muestra. Las secuencias "omitidas" constituyen la muestra OOB. En promedio, cada árbol se cultiva utilizando aproximadamente 1 − e−1 ≅ 2/3 de las secuencias de entrenamiento, dejando e−1 ≅ 1/3 como OOB. Debido a que las secuencias OOB no se han utilizado en la construcción del árbol, se pueden utilizar para estimar el rendimiento de la predicción25. El algoritmo RF fue implementado por el paquete R “randomForest”26. Primero clasificamos la importancia del gen según la prueba de permutación para lograr el mejor rendimiento de predicción mediante una cantidad mínima de genes. Específicamente, permutamos los patrones de expresión de cada gen y calculamos los cambios de error de predicción para cada permutación. Intuitivamente, si un gen es esencial, la permutación dará como resultado una disminución significativa en el rendimiento de la predicción. Por lo tanto, podemos clasificar la importancia del gen en función de los cambios en el error de predicción para cada permutación. Luego, utilizamos un método de selección de características directas (es decir, agregar cada gen a la vez, comenzando con los 3 genes más esenciales) para seleccionar una cantidad mínima de genes que puedan lograr el mejor rendimiento. El rendimiento de la predicción se calculó mediante el coeficiente de correlación de Pearson (R) entre las densidades de capilares acelulares observadas y predichas. Identificamos que la combinación de los 14 genes principales logró el mejor coeficiente de correlación de Pearson (R). Por lo tanto, utilizamos los patrones de expresión genética de los 14 genes mejor clasificados como características para construir un modelo RFR para predecir la densidad capilar acelular.

El aumento de la densidad capilar acelular es uno de los primeros signos detectables de retinopatía diabética9,10. Los capilares acelulares son segmentos capilares sin núcleos a lo largo de su longitud, como se muestra en la Fig. 1 (capilares acelulares de la retina de la rata del Nilo; indicados como flechas). La hiperglucemia es un factor de riesgo bien conocido para el aumento de los capilares acelulares9,10. Sin embargo, no está claro cómo se relaciona la densidad capilar acelular con tres factores relevantes de la diabetes tipo 2: los niveles de glucosa en sangre, la dieta y el sexo. Primero, realizamos un análisis de correlación de rangos de Spearman (N = 32; ratas del Nilo; consulte la Tabla complementaria 1) para investigar la correlación entre el nivel aleatorio de glucosa en sangre (RBG) y la densidad capilar acelular. Como se muestra en la Fig. 2A, el RBG está moderadamente asociado con la densidad capilar acelular (coeficiente de correlación de Spearman Rho = 0,31, valor P = 0,09), lo que indica una relación positiva pero compleja entre el RBG y la densidad capilar acelular, donde la tendencia es más obvia. en el rango prediabético de RBG. También observamos que algunas ratas del Nilo con alta densidad capilar acelular no tienen hiperglucemia. A continuación, investigamos el papel de la dieta. Las ratas del Nilo con una dieta rica en calorías tienen RBG más alta en comparación con las ratas del Nilo con una dieta rica en fibra (Fig. 2B, prueba exacta de suma de rangos de Wilcoxon, valor P = 1,38e-05). En nuestra cohorte de estudio, el 61,9% de las ratas del Nilo con una dieta alta en calorías aún no habían desarrollado hiperglucemia, definida como RBG > 100 mg/dL9. Por lo tanto, podríamos investigar si la dieta podría afectar la densidad capilar acelular independientemente de la RBG. Además, dado que la retinopatía puede tener diferencias entre hombres y mujeres, también incluimos el sexo en nuestro análisis de densidad capilar acelular. Para comprender los factores individuales que contribuyen al aumento de la densidad capilar acelular, desarrollamos una red bayesiana (BN) para calcular la probabilidad condicional de una alta densidad capilar acelular según la RBG, la dieta y el sexo. Como se muestra en la Fig. 2C, la probabilidad de una alta densidad capilar acelular aumenta progresivamente cuando se combinan factores como el nivel de glucosa en sangre, la dieta y el sexo. Por ejemplo, una rata del Nilo con una dieta alta en calorías tendrá un 43,07% de posibilidades de desarrollar una densidad capilar acelular superior a 10 cuentas por mm2. Esta probabilidad aumenta al 62,0% si esta rata del Nilo también tiene un RBG > 100 mg/dL. Además, si esta rata del Nilo es macho, la posibilidad aumentará aún más hasta el 80,56%. Por lo tanto, una rata macho del Nilo con una dieta rica en calorías y un nivel alto de glucosa en sangre tendrá muchas más posibilidades de presentar una alta densidad capilar acelular, un marcador cuantitativo de retinopatía temprana.

Demostración de los capilares acelulares de la retina de la rata del Nilo y el diseño experimental general para RNA-seq. Las flechas indican capilares acelulares. Los capilares acelulares son tubos vasculares del tamaño de un capilar sin núcleo que se consideran un síntoma clave de la etapa inicial de la retinopatía.

Factores asociados al aumento de la densidad de capilares acelulares (ACD). (A) La glucosa en sangre aleatoria (RBG) está moderadamente asociada con la ACD (coeficiente de correlación de rango de Spearman Rho = 0,31, valor de P = 0,09); (B) La dieta alta en calorías se asocia significativamente con niveles elevados de glucosa en sangre aleatoria (RBG) (prueba exacta de suma de rangos de Wilcoxon, valor P = 1,38e-05); (C) La red bayesiana que modela la probabilidad condicional de ACD relativamente más alta (> 10 recuentos por mm2) sugiere que los factores combinados de RBG alto, dieta alta en calorías y el hombre darán como resultado un aumento del doble en la probabilidad de ACD alta que cualquier factor. solo.

Nuestra hipótesis es que la vasculatura de la retina contiene señales moleculares que impulsan las primeras etapas de la patogénesis de la retinopatía. Para probar nuestra hipótesis, realizamos RNA-seq en todos estos tejidos vasculares de la retina (ver métodos) de ratas del Nilo. Tenemos 32 ratas del Nilo en total con un gran rango dinámico de densidad capilar acelular de 2,9 a 17,9 (mediana: ~ 10) recuentos por mm2. Sin embargo, cuatro muestras de ratas del Nilo no pasaron el control de calidad (QC) durante el paso de la biblioteca de RNA-seq y, por lo tanto, fueron excluidas del análisis de datos de RNA-seq (Tabla complementaria 1). Por lo tanto, hay 28 datos de secuenciación de ARN vascular de retina de rata del Nilo en total. Los valores de expresión génica de las vasculaturas retinianas se cuantificaron como valores normalizados de TPM (transcripción por millón). Realizamos un análisis de regresión segmentada para identificar firmas genéticas asociadas con una densidad capilar acelular elevada (ver Métodos). Como se muestra en la Fig. 3, identificamos cuatro categorías principales de patrones de expresión genética asociadas con ACD elevada: Arriba (expresión genética regulada positivamente); Down (expresión genética regulada a la baja); Arriba-Abajo (la expresión genética primero aumenta y luego sigue una regulación descendente); Down-Up (la expresión genética primero disminuye y luego sigue una regulación positiva). Se pueden ver ejemplos de cada patrón en la Fig. 3B. Curiosamente, el término de ontología genética (GO) (desarrollo de astrocitos) es el más enriquecido en genes con el patrón Up. Los estudios han demostrado que la glucosa controla estrechamente las funciones morfológicas de los astrocitos27, lo que sugiere un impacto directo o indirecto de la hiperglucemia en los cambios transcriptómicos de la vasculatura retiniana. Los genes regulados negativamente (correlacionados negativamente con la densidad capilar acelular) están enriquecidos en ADN y funciones relacionadas con la reparación/respuesta celular, como la reparación de enlaces cruzados entre cadenas. Se sabe que la degeneración macular (una capa sensible a la luz en el centro de la retina) está estrechamente asociada con un deterioro del mecanismo de reparación y daño del ADN de la retina28,29, que se caracteriza por la sensibilidad del epitelio pigmentario de la retina (EPR) al azul y Exposición a luces ultravioleta. Curiosamente, el mecanismo de reparación del daño del ADN deteriorado se observa tanto en la degeneración macular como en la retinopatía temprana. Los patrones Arriba-Abajo y Abajo-Arriba están asociados con una amplia gama de funciones biológicas (consulte la Tabla complementaria 2), como la cadena de transporte de electrones (patrón Arriba-Abajo) y la regulación de los patrones de maduración neuronal (Abajo-Arriba), lo que indica la Complejidad de los cambios transcriptómicos dinámicos en respuesta a una densidad capilar acelular elevada. Los términos de ontología de genes enriquecidos principales para cada patrón se muestran en la Fig. 3C.

Diferentes patrones de expresión genética están asociados con una elevada densidad de capilares acelulares (ACD). (A) El análisis de regresión segmentada identificó cuatro patrones (arriba, abajo, arriba-abajo y abajo-arriba) asociados con una ACD elevada con una tasa de descubrimiento falso (FDR) <5%; (B) Ejemplos de cada patrón; (C) Los 3 términos principales de ontología genética enriquecida (GO) para cada patrón.

Nuestra hipótesis es que las características patológicas de una retina disfuncional están codificadas en sus patrones transcriptómicos. Por lo tanto, los cambios sutiles asociados con la progresión temprana de la retinopatía diabética, cuantificados por la densidad capilar acelular, se pueden inferir a partir de una combinación de patrones de expresión genética. Para identificar una cantidad mínima de genes que puedan usarse para imputar la densidad capilar acelular, desarrollamos un modelo de regresión forestal aleatoria (RFR). Clasificamos la importancia del gen según el rendimiento de la predicción que cambia mediante la prueba de permutación (es decir, permutación de patrones de expresión genética para cada gen). Luego utilizamos un método de selección de características directas (es decir, agregar cada gen a la vez) para seleccionar una cantidad mínima de genes que puedan lograr el mejor rendimiento (ver Métodos). Como se muestra en la Fig. 4A, identificamos una combinación de 14 genes que pueden predecir la densidad capilar acelular con alta precisión (coeficiente de correlación de Pearson R = 0,91; Fig. 4B). Sugiere que la densidad capilar acelular está codificada de forma única en los patrones de expresión genética de estos 14 genes, y un modelo de regresión de aprendizaje automático puede decodificar las señales transcriptómicas asociadas con esta característica temprana de la retinopatía.

Modelo de regresión de bosque aleatorio para predecir la densidad de capilares acelulares. (A) El modelo de regresión de bosque aleatorio identificó una combinación de 14 genes que pueden predecir cuantitativamente la densidad de los capilares acelulares. (B) La densidad de capilares acelulares prevista está altamente correlacionada con la densidad de capilares acelulares observada.

Actualmente, no existen formas efectivas de tratar o revertir la retinopatía temprana. La evidencia emergente sugiere que la reversión de los patrones de expresión de genes de enfermedades se correlaciona bien con la eficacia de los fármacos y revela objetivos terapéuticos30. Específicamente, si una pequeña molécula o compuesto puede revertir total o parcialmente los patrones de expresión de genes marcadores de enfermedades, puede ser un posible fármaco para el tratamiento de enfermedades. Dado que la densidad capilar acelular elevada es una de las características cuantitativas más tempranas de la retinopatía diabética, planteamos la hipótesis de que si un compuesto puede revertir total o parcialmente el transcriptoma asociado a la densidad capilar acelular, podría ser un supuesto fármaco candidato para alterar la progresión hacia la pérdida de visión. . Con este fin, identificamos genes que se correlacionan positiva o negativamente con los niveles de densidad capilar acelular mediante el análisis de correlación de rangos de Spearman (coeficiente de correlación absoluta (Rho)> 0,4; Fig. 5). Generalmente se considera que los valores absolutos de Rho superiores a 0,4 tienen patrones correlacionados31. Luego buscamos en la base de datos de expresión génica perturbada del compuesto químico LINCS L100032 para encontrar medicamentos que potencialmente podrían revertir este patrón (es decir, un compuesto que puede regular negativamente la expresión genética de los genes correlacionados positivamente con la densidad capilar acelular mientras que regula positivamente la expresión génica de los genes capilares acelulares). densidad de genes correlacionados negativamente). Descubrimos que NVP-TAE684, geldanamicina y NVP-AUY922 son los tres compuestos principales identificados para revertir potencialmente el fenotipo vascular retiniano asociado con una alta densidad capilar acelular (Fig. 5). NVP-TAE684 es un inhibidor de la quinasa del linfoma anaplásico (ALK). ALK es un receptor tirosina quinasa que pertenece a la superfamilia de receptores de insulina y que comparte un alto grado de homología con la tirosina quinasa leucocitaria (LTK)33. Tanto geldanamicina como NVP-AUY922 son inhibidores de Hsp9011,12. Curiosamente, los estudios han demostrado que un tratamiento de corta duración con el inhibidor de Hsp90 puede estimular una respuesta al estrés de la retina con expresión de chaperonas moleculares, previniendo la degeneración de la retina en modelos de retinitis pigmentosa y degeneración macular relacionada con la edad13. Aunque ningún estudio muestra que los inhibidores de Hsp90 puedan usarse para tratar la retinopatía temprana, existe evidencia de que los inhibidores de Hsp90, como AUY922, pueden proteger y reparar las células endoteliales microvasculares relacionadas con la disfunción de la barrera endotelial en un contexto biológico diferente (p. ej., pulmón humano34). La disfunción endotelial de la retina es una complicación importante que impulsa la retinopatía diabética35,36. Por lo tanto, es probable que los inhibidores de Hsp90 (geldanamicina y NVP-AUY922) puedan potencialmente tratar o proteger la retinopatía temprana mediante la modulación de las células endoteliales microvasculares.

Identificación de supuestos candidatos que pueden reducir la densidad capilar acelular mediante transcriptoma inverso. El mapa de calor muestra genes con |Rho|> 0,4 ​​entre los valores de expresión génica y la densidad de capilares acelulares (ACD). La búsqueda en la base de datos de expresión genética perturbada del compuesto químico LINCS L1000 identificó a NVP-TAE684, geldanamicina y NVP-AUY922 como los tres candidatos principales.

Para evaluar más a fondo nuestros medicamentos previstos, realizamos un enfoque de minería de textos. Enumeramos un conjunto de características anatómicas asociadas a la retinopatía: microaneurisma, pérdida de pericitos, hemorragias puntiformes, hemorragias intrarretinianas, exudados duros, manchas algodonosas, neovascularización, formación de cuentas venosas, isquemia. Luego utilizamos una herramienta de minería de textos (KinderMiner: https://www.kinderminer.org/login) para calcular si los compuestos predichos (NVP-TAE684, geldanamicina y NVP-AUY922) están estadísticamente enriquecidos en cualquiera de las características anatómicas asociadas a la retinopatía. características enumeradas anteriormente mediante el escaneo de 34.006.217 artículos de PubMed). Encontramos que la geldanamicina está estadísticamente enriquecida en el término "Neovascularización" (valor P = 0,001) y en el término "Isquemia" (valor P = 8,7E-10). Dado que tanto geldanamicina como NVP-AUY922 son inhibidores de Hsp90, calculamos además los valores de P de enriquecimiento del término "inhibidores de Hsp90" en las características anatómicas asociadas a la retinopatía según la herramienta KinderMiner. El término "inhibidores de Hsp90" está estadísticamente enriquecido en "término de neovascularización" (valor de P = 0,02) y término de "isquemia" (valor de P = 6,6E-5). Esto apoyó indirectamente que nuestros inhibidores de Hsp90 previstos (geldanamicina y NVP-AUY922) podrían potencialmente atenuar o mitigar la retinopatía diabética prodrómica.

La retinopatía diabética es una enfermedad progresiva que eventualmente conducirá a la pérdida de la visión. Aunque los avances tecnológicos actuales han permitido una fácil detección de la retinopatía temprana antes de cualquier deterioro de la visión, faltan estrategias para abordar la retinopatía temprana y prevenir la pérdida de la visión. Los tejidos humanos que presentan retinopatía temprana apenas están disponibles. De ahí la necesidad de modelos animales. Las ratas diabéticas del Nilo desarrollan lesiones retinianas similares a la retinopatía diabética humana asociada con la pérdida de visión9, que pueden surgir de mecanismos moleculares compartidos.

En nuestro estudio anterior, encontramos que la densidad capilar acelular es una característica cuantitativa asociada con factores de riesgo de retinopatía diabética, al menos en el modelo de rata del Nilo. La densidad capilar acelular es evidente antes con un gran rango dinámico en comparación con otros cambios característicos vasculares como la pérdida de pericitos (pequeño rango dinámico) y lesiones neuronales (aparentes más tarde) en la rata del Nilo. Nuestra hipótesis es que las firmas moleculares que inician la retinopatía temprana están codificadas en la vasculatura retiniana y, por lo tanto, también están asociadas con la densidad capilar acelular. Desarrollamos un modelo de aprendizaje automático mediante patrones de expresión genética de catorce genes que pueden predecir cuantitativamente la densidad capilar acelular. Dado que la densidad capilar acelular es una característica cuantitativa asociada con la retinopatía diabética temprana, nuestro modelo se puede utilizar como un "reloj transcriptómico" de progresión temprana de la retinopatía que mide la gravedad o la progresión de la retinopatía temprana. Sin embargo, reconocemos que este modelo se basó en datos de retinopatía diabética de ratas del Nilo. Se necesitan comparaciones con otros modelos animales y humanos para validar el patrón de expresión genética y si este modelo de predicción es consistente entre especies.

La evidencia emergente sugiere que la reversión de los patrones de expresión de genes de enfermedades se correlaciona bien con la eficacia de los fármacos30. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que si una molécula pequeña o un fármaco puede revertir la mayoría o una fracción significativa de los cambios en la expresión genética impulsados ​​por la DR, puede ser un supuesto candidato a fármaco para el tratamiento de la DR. Utilizamos firmas genéticas reguladas hacia arriba y hacia abajo asociadas a la densidad capilar acelular para identificar fármacos que potencialmente pueden revertir o revertir parcialmente dichos patrones mediante la búsqueda en la base de datos de expresión génica perturbada del compuesto químico LINCS L100032. La base fundamental de este enfoque supone que abordar los cambios vasculares tempranos es la clave para bloquear la retinopatía temprana. Esta suposición se basa en nuestro estudio previo de que la elevada densidad capilar acelular era un rasgo cuantitativo confiable presente en el desarrollo inicial de la retinopatía que precede a una disfunción vascular adicional en los pericitos y las células endoteliales. Entre los tres fármacos más predichos, geldanamicina y NVP-AUY922 se encuentran inhibidores de Hsp9011,12. Algunos estudios han demostrado que los inhibidores de Hsp90 pueden proteger y reparar las células endoteliales microvasculares relacionadas con la disfunción de la barrera endotelial pero en un contexto biológico diferente: los pulmones humanos34. Aunque necesitamos más estudios in vivo en el futuro para respaldar nuestros hallazgos, proporcionamos un enfoque basado en datos para reutilizar los medicamentos de tratamiento, lo que puede acortar en gran medida el camino tradicional de descubrimiento de fármacos. Sin embargo, también reconocemos que se necesitan estudios in vivo e in vitro para validar aún más estos medicamentos reutilizados.

Nuestro estudio no solo brinda información transcriptómica sobre la patogénesis de la retinopatía en etapa temprana, sino que también proporciona un enfoque novedoso basado en datos para priorizar y reutilizar los medicamentos de tratamiento.

Hemos enviado los datos de RNA-seq y los datos de expresión génica (TPM y recuentos de mapeo) a GEO (número de acceso: GSE220672).

Retinopatía diabética

red bayesiana

Glucosa en sangre aleatoria

Densidad capilar acelular

Ontología de genes

Regresión forestal aleatoria

Fuera de bolsa

Epitelio pigmentario de la retina

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Descargar referencias

Agradecemos a Jennifer Bolin y Jessica Antosiewicz-Bourget por su apoyo técnico (RNA-seq). También agradecemos a Xiujie Li por la discusión y sugerencias para este proyecto. Agradecemos el apoyo del Centro para la Regulación Genética en Salud y Enfermedades (GRHD) de la Universidad Estatal de Cleveland y al Prof. Anton Komar.

Este estudio fue apoyado por la Iniciativa Garland para la Visión, financiada por la Fundación William K. Bowes Jr. Peng Jiang también recibe financiación de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA) (D20AC00002).

Instituto de Investigación en Neurociencia, Universidad de California en Santa Bárbara, Santa Bárbara, CA, EE. UU.

Huishi Toh, Alexander Smolentsev, Ryan Sadjadi, Dennis Clegg y James A. Thomson

Departamento de Biología Molecular, Celular y del Desarrollo, Universidad de California Santa Bárbara, Santa Bárbara, CA, EE. UU.

Dennis Clegg y James A. Thomson

Instituto Morgridge de Investigación, Madison, WI, 53706, EE. UU.

Ron Stewart y James A. Thomson

Departamento de Ciencias Biológicas, Geológicas y Ambientales, Universidad Estatal de Cleveland, Cleveland, OH, 44115, EE. UU.

Jingqi Yan y Peng Jiang

Centro de Regulación Genética en Salud y Enfermedades, Universidad Estatal de Cleveland, Cleveland, OH, 44115, EE. UU.

Jingqi Yan y Peng Jiang

Centro de Ciencia y Terapéutica del ARN, Facultad de Medicina, Universidad Case Western Reserve, 10900 Euclid Avenue, Cleveland, OH, 44106, EE. UU.

Peng Jiang

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Experimento con ratas del Nilo: HT, AS y RS (Ryan); Análisis y modelado de datos: PJ; Soporte técnico y de laboratorio: DC, JY, RS (Ron); Redacción de manuscritos: HT, PJ; Supervisión: JAT y PJ

Correspondencia a Peng Jiang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Toh, H., Smolentsev, A., Sadjadi, R. et al. El reloj transcriptómico predice los cambios vasculares de la retinopatía diabética prodrómica. Informe científico 13, 12968 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40328-w

Descargar cita

Recibido: 31 de marzo de 2023

Aceptado: 08 de agosto de 2023

Publicado: 10 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40328-w

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